吉米沙星关键中间体4-氨甲基吡咯烷-3-酮-O-甲基肟 二盐酸盐的合成方法改进

目的 合成抗菌药吉米沙星关键中间体4-氨甲基吡咯烷-3-酮-O-甲基肟二盐酸盐。方法 以甘氨酸乙酯盐酸盐为原料,依次经加成、BOC保护氨基、Dieckmann环化、NaBH4还原羰基、LiAlH4还原氰基、BOC保护氨甲基、氧化、肟化、脱BOC保护等9步反应制得目标化合物。结果与结论 合成的目标化合物经1H-NMR和MS谱确证结构,总收率由25.8%提高至39.6%。该合成工艺省去了文献方法中对中间体4和6的柱色谱分离,不经纯化直接用于下步反应,简化了操作步骤。     

岩舒注射液克服人乳腺癌MCF-7细胞多药耐药性的实验研究

目的观察岩舒注射液能否克服人乳腺癌MCF-7细胞的多药耐药性。方法使用人乳腺癌MCF-7和耐多柔比星的MCF-7／DOX细胞进行实验。采用MTT法检测岩舒注射液对细胞增殖的影响,流式细胞术检测岩舒注射液处理后细胞内多柔比星的荧光强度变化,免疫印迹方法检测岩舒注射液处理后凋亡相关蛋白和P-糖蛋白的表达变化。结果岩舒注射液处理耐药和敏感细胞的抑制率相近,没有明显的交叉耐药性（P〉0．05）。原药1／16浓度的岩舒注射液能明显地引起两种细胞凋亡。5nmol／L多柔比星和1／256、1／128浓度的岩舒注射液合用处理MCF-7／DOX耐药细胞,细胞的存活率分别从86．8％降低至74．6％（P〈0．05）和71．6％（P〈0．01）,具有明显的增效作用。此外,岩舒注射液还能增加多柔比星在耐药细胞内的积聚。免疫印迹检测显示：岩舒注射液处理使耐药细胞P-糖蛋白表达水平下降。结论岩舒注射液能够克服人乳腺癌MCF-7细胞的多药耐药性,其机制是降低P-糖蛋白的表达。     

文蛤体液蛋白体内外抗肿瘤作用的研究

[摘要]目的：由文蛤体液中获得一种新的抗肿瘤蛋白。方法：采用电镜技术、流式细胞仪技术、微管蛋白α-tubulin的荧光染色技术、电泳技术,研究了MML作用后细胞凋亡、细胞周期及微管蛋白的变化情况;建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,观察MML的体内抗肿瘤活性。结果：发现MML可显著抑制肿瘤细胞生长, IC50达到52.2μg•mL-1。作用机制的研究表明MML可以增加肿瘤细胞膜通透性、抑制微管蛋白聚合、使肿瘤细胞停滞在G2/M期;MML对人肝癌BEL-7402移植性肿瘤小鼠具有显著的抗肿瘤作用。结论：文蛤体液蛋白是一种新型的抗肿瘤蛋白,主要通过增加细胞膜的通透性、引起细胞凋亡、抑制微管蛋白聚合产生抗肿瘤作用。     

Plk1 PBD蛋白原核表达、分离纯化与活性鉴定

目的：原核表达保罗样激酶1底物结合域（Polo-like kinase 1 Polo-box domain,Plk1 PBD）蛋白,经分离纯化后进行生物学活性鉴定。方法：以HeLa cDNA为模板经PCR反应扩增Plk1 PBD基因,利用DNA重组技术与pET-28a载体连接构建重组质粒。将重组质粒转化到E.coli Rosetta（DE3）,经诱导培养后进行Plk1 PBD蛋白原核表达。采用亲和层析方法分离纯化Plk1 PBD蛋白后,以酶联免疫吸附测定实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和荧光偏振实验（fluorescence polarization,FP）进行生物学活性鉴定。结果：测序与重组质粒酶切结果表明,成功构建了pET-28a-Plk1 PBD原核表达质粒。SDS-PAGE电泳和Western blot实验证实了Plk1 PBD蛋白的原核表达。ELISA实验和FP实验表明Plk1 PBD蛋白具有良好的生物学活性。结论：成功进行了Plk1 PBD蛋白的原核表达、分离纯化与活性鉴定,为其生物学功能研究及以Plk1 PBD蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物发现奠定了基础。     

以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用

目的建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型,筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂,获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,pET28a表达质粒为载体,将alr基因克隆至pET28a,构建pET28a::alr重组表达质粒,表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶;通过测定反应产物NADH在340 nm处光密度变化速率,检测酶反应活性,构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型;应用该模型对化合物库进行筛选;测定活性化合物IC50以及对结核分枝杆菌的MIC。结果成功构建了结核分枝杆菌alr基因的表达载体;得到了纯度较高的重组丙氨酸消旋酶,测得该酶的比活力为13.53 kU/mg;所建立的丙氨酸消旋酶高通量筛选模型稳定性高,符合高通量筛选的要求;通过对70 000个化合物进行筛选,得到了5个活性较高的化合物,其中,IMB-XZ5对结核分枝杆菌的MIC为4~8μg/ml,且对结核分枝杆菌的作用具有较高的特异性。结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶抑制剂高通量筛选模型,应用该模型筛选得到了具有较好抗结核活性的丙氨酸消旋酶抑制剂。     

人载脂蛋白A-I表达上调剂的发现与活性研究

目的筛选上调人载脂蛋白A-I(ApoA-I)基因表达的新型活性化合物,并在表达和功能水平对其作用进行研究。方法利用人ApoA-I基因表达上调剂筛选模型对化合物库进行筛选;对发现的活性化合物在ApoA-I启动子水平进行量效关系研究;利用实时荧光定量RT-PCR检测ApoA-I mRNA的表达水平;利用Western blot、ELISA和流式细胞技术检测ApoA-I的蛋白表达;利用胆固醇流出试验检测ApoA-I介导的巨噬细胞胆固醇外流的情况。结果从20 000样次化合物筛选中得到活性化合物5238B-69,在一定浓度范围内存在转录调控活性的量-效关系,当化合物浓度为0.30μg/ml时,上调ApoA-I表达活性达到最高值(408%),EC50为0.01μg/ml。5238B-69能显著上调HepG2细胞中ApoA-I mRNA的水平;同时,Western blot结果显示5238B-69能增加HepG2细胞ApoA-I蛋白的表达。ELISA结果显示,与对照相比,5238B-69作用48 h时,胞外ApoA-I水平增加了48%,流式细胞检测表明,5238B-69作用24 h后,胞内ApoA-I蛋白水平增加了21.4%。功能分析试验显示,5238B-69作用HepG2细胞上调生成的ApoA-I,能促进巨噬细胞RAW264.7内[3H]标记的胆固醇的流出。结论得到一个具有上调ApoA-I表达的活性化合物,在提高ApoA-I表达水平和生物学功能方面均有明显的效果。     

核糖体蛋白L12-L10相互作用抑制剂的筛选及其抗结核活性的研究

目的以L12-L10相互作用为靶点筛选具有抗结核活性的先导化合物。方法应用酵母双杂交模型AH109(pAD-L12+pBD-L10)通过生长抑制方法筛选阳性化合物,以AH109(pAD-T+pBD-53)作为对照;通过96孔板法检测阳性化合物对耻垢分枝杆菌的抑制活性;应用定量微孔板快速显色法(MABA)检测抗结核杆菌活性;通过β-半乳糖苷酶活性定量检测判断阳性化合物在模型上对L12-L10相互作用的阻断活性;应用体外蛋白表达系统检测阳性化合物对蛋白表达的抑制作用;应用平皿二倍稀释法检测阳性化合物的药敏作用。结果筛选到4个在模型上具有活性的阳性化合物,其对耻垢分枝杆菌具有比较好的抑制活性,其最小抑制浓度(MIC)在3.125~12.5μg/ml之间;其中IBM-T275对结核分枝杆菌标准株和临床分离株均具有比较好的抑制活性,MIC在5~10μg/ml之间,而对细菌抑制活性较低,其MIC均在64μg/ml以上;IBM-T275能够抑制酵母模型内β-半乳糖苷酶的表达,并且能够体外抑制蛋白表达,其IC50为12.57μg/ml。结论筛选到1个具有抗结核杆菌活性的阳性化合物,其抗结核活性可能与阻断L12-L10蛋白相互作用相关。     

响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。